Фаги — взять под контроль
Автор: Ирина Лапшевич, менеджер-технолог компании Культура Молока. В молочной отрасли - с 2014 ода, в пищевой промышленности - с 1996-го. Опыт: разработка заквасочных культур для российского рынка, запуск производства различных групп сыров, технологическая поддержка ведущих предприятий молочной отрасли. Фокус в экспертизе: технология кисломолочных продуктов и сыра, фаговый аудит и мониторинг
На протяжении десятилетий фаги считались «врагами» в различных промышленных отраслях. Проблемы, связанные с фагами, отмечались не только в пищевой промышленности, но и на фармацевтических, химических и сельскохозяйственных предприятиях.
Первые серьёзные проблемы, вызванные присутствием фагов и заражении молочнокислых стрептококков, были описаны и исследованы в молочной промышленности более 80 лет назад.
Производство сыра, йогурта и других кисломолочных продуктов зависит от правильного процесса кислотообразования. Основным признаком заражения фагом на предприятии переработки молока является снижение активности закваски, что приводит к частичной или полной остановке ферментации.
По этой причине крайне важно выявить источники и места скопления фагов на предприятии для принятия корректирующих мер по ограничению их распространения.
Первые серьёзные проблемы, вызванные присутствием фагов и заражении молочнокислых стрептококков, были описаны и исследованы в молочной промышленности более 80 лет назад.
Производство сыра, йогурта и других кисломолочных продуктов зависит от правильного процесса кислотообразования. Основным признаком заражения фагом на предприятии переработки молока является снижение активности закваски, что приводит к частичной или полной остановке ферментации.
По этой причине крайне важно выявить источники и места скопления фагов на предприятии для принятия корректирующих мер по ограничению их распространения.
Откуда берутся фаги?
Хотя существует несколько источников загрязнения, основным путем проникновения фагов на молочные предприятия, является сырое молоко, которое может содержать до 10⁴ в мл. Считается, что титры фагов около 10⁶-10⁷ в мл приводят к значительным сбоям ферментации. Но и небольшие концентрации до 10² в мл уже могут вызывать проблемы, даже если они не влияют на процесс сквашивания.
Стоит отметить, что движение воздуха и брызги жидкостей вокруг резервуаров и других загрязненных поверхностей приводят к образованию биоаэрозолей, которые остаются в воздухе в течение длительного времени и также считаются основным путем распространения фагов на молочных заводах. Таким образом, фаги могут распространяться по всей производственной среде.
Исследования показали, что рабочие поверхности тоже представляют собой источник фагового загрязнения на молочных предприятиях. Присутствие лактококковых фагов было обнаружено на полах, стенах, лестницах, дверных ручках, столах, оборудовании, в чистящих средствах и трубах.
В последнее время растет интерес к использованию переработанной сыворотки в качестве добавки в каши, детские смеси, напитки и молочные продукты, что позволяет улучшить выход, текстуру и качество конечного продукта.
Можно сказать с большой уверенностью, что фаги могут выживать и размножаться в сыворотке, достигая высоких титров. Количество фагов может даже увеличиться примерно на 1 логарифмический порядок, если сыворотку концентрируют путем выпаривания или мембранной фильтрации.
Это представляет серьезную экономическую проблему, учитывая высокую частоту фаговых атак на молочных заводах и растущие объемы перерабатываемой сыворотки. Поэтому при использовании сыворотки для производства молочных продуктов следует учитывать, что данное сырье может содержать фаги в высоких концентрациях.
Стоит отметить, что движение воздуха и брызги жидкостей вокруг резервуаров и других загрязненных поверхностей приводят к образованию биоаэрозолей, которые остаются в воздухе в течение длительного времени и также считаются основным путем распространения фагов на молочных заводах. Таким образом, фаги могут распространяться по всей производственной среде.
Исследования показали, что рабочие поверхности тоже представляют собой источник фагового загрязнения на молочных предприятиях. Присутствие лактококковых фагов было обнаружено на полах, стенах, лестницах, дверных ручках, столах, оборудовании, в чистящих средствах и трубах.
В последнее время растет интерес к использованию переработанной сыворотки в качестве добавки в каши, детские смеси, напитки и молочные продукты, что позволяет улучшить выход, текстуру и качество конечного продукта.
Можно сказать с большой уверенностью, что фаги могут выживать и размножаться в сыворотке, достигая высоких титров. Количество фагов может даже увеличиться примерно на 1 логарифмический порядок, если сыворотку концентрируют путем выпаривания или мембранной фильтрации.
Это представляет серьезную экономическую проблему, учитывая высокую частоту фаговых атак на молочных заводах и растущие объемы перерабатываемой сыворотки. Поэтому при использовании сыворотки для производства молочных продуктов следует учитывать, что данное сырье может содержать фаги в высоких концентрациях.
Фаги: возможные решения
Важное значение для контроля фагового уровня на молочном предприятии имеют используемые заквасочные культуры. Культуры молочнокислых бактерий могут состоять из неопределённых (натуральные закваски) или определённых (селектированные закваски) штаммов.
Первые обладают основной микрофлорой, в которой преобладают различные штаммы молочнокислых бактерий. Кроме того, они также содержат вторичную, сложную микрофлору, состоящую из небольшого количества Lactobacillus sp. и других бактерий.
Бактериальное разнообразие натуральных заквасок позволяет получать сыры со вкусом и ароматом, аналогичными сырам, приготовленным из сырого молока, и обеспечивает высокую устойчивость заквасок к фаговой инфекции, учитывая, что популяции бактерий и фагов сосуществуют в общей и саморегулируемой среде.
Однако, непостоянный состав и активность натуральных заквасок не позволяют контролировать ключевые параметры ферментации, поэтому их активно заменили селекционированные культуры DVS.
Закваски DVS обычно содержат несколько отобранных штаммов, которые производят молочную кислоту из лактозы с предсказуемой и контролируемой скоростью, что позволяет получать продукты с постоянным высоким качеством, которое сохраняется на протяжении всего срока годности.
Правильный выбор штаммов для культур DVS — это длительный и сложный процесс, основанный на биохимических, микробиологических и технологических критериях, которые зависят от специфики производимого продукта. Поскольку в культурах DVS присутствует лишь несколько штаммов, то при наличии специфических фагов в молоке (сыром или пастеризованном), на поверхностях оборудования или в окружающей среде молочного завода могут быстро проявится фаговые атаки. Следовательно, устойчивость к фагам становится одним из основных критериев отбора штаммов.
Первые обладают основной микрофлорой, в которой преобладают различные штаммы молочнокислых бактерий. Кроме того, они также содержат вторичную, сложную микрофлору, состоящую из небольшого количества Lactobacillus sp. и других бактерий.
Бактериальное разнообразие натуральных заквасок позволяет получать сыры со вкусом и ароматом, аналогичными сырам, приготовленным из сырого молока, и обеспечивает высокую устойчивость заквасок к фаговой инфекции, учитывая, что популяции бактерий и фагов сосуществуют в общей и саморегулируемой среде.
Однако, непостоянный состав и активность натуральных заквасок не позволяют контролировать ключевые параметры ферментации, поэтому их активно заменили селекционированные культуры DVS.
Закваски DVS обычно содержат несколько отобранных штаммов, которые производят молочную кислоту из лактозы с предсказуемой и контролируемой скоростью, что позволяет получать продукты с постоянным высоким качеством, которое сохраняется на протяжении всего срока годности.
Правильный выбор штаммов для культур DVS — это длительный и сложный процесс, основанный на биохимических, микробиологических и технологических критериях, которые зависят от специфики производимого продукта. Поскольку в культурах DVS присутствует лишь несколько штаммов, то при наличии специфических фагов в молоке (сыром или пастеризованном), на поверхностях оборудования или в окружающей среде молочного завода могут быстро проявится фаговые атаки. Следовательно, устойчивость к фагам становится одним из основных критериев отбора штаммов.
Фаги: главное — контроль
Контроль на производстве должен быть направлен на снижение уровня фагов и предотвращение их распространения. Применяемые в этом случае меры могут быть физическими (нагрев, фильтрация, обработка высоким давлением, УФ-излучением, электроимпульсная обработка), химическими (биоциды) или биологическими (ротация штаммов, использование штаммов с повышенной устойчивостью к фагам).
При производстве молочных продуктов сырое молоко подвергают термической обработке, чтобы уничтожить большинство присутствующих в нём микроорганизмов, в том числе вызывающих порчу и патогенных, тем самым обеспечивая высокое качество и более длительный срок хранения конечного продукта.
Однако, комбинации температуры и времени, часто используемые для пастеризации молока, то есть низкая температура/длительное время (63 °C, 30 мин) или высокая температура/короткое время (72 °C, 15 с) недостаточны для уничтожения большинства фагов молочнокислых бактерий.
Особенно высокая термоустойчивость наблюдалась у фагов, инфицирующих Lc. lactis, Lactobacillus helveticus, Strep. thermophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Leuconostoc pseudomesenteroides, Leuconostoc mesenteroides и Lactobacillus delbrueckii. Для уничтожения 99% фагов путем термической обработки молока при 72 °C потребовалось длительное время — до 300 минут.
Важно учитывать, что фаги обычно весьма чувствительны к кислым (pH < 4) и щелочным (pH > 11) средам. Например, гипохлорит натрия, этанол и изопропанол не обеспечивают значительного снижения количества фагов. Гипохлорит натрия показывает хорошую эффективность только в концентрациях, превышающих допустимые в пищевой промышленности.
Надуксусная кислота, дезинфицирующие средства и другие биоциды с экстремальными значениями pH, такие как щелочная хлоридная пена (pH 12,7) и этоксилированный нонилфенол с фосфорной кислотой (pH 1,7), продемонстрировали хороший эффект в инактивации фагов. При использовании биоцидов в концентрациях, рекомендованных производителями, фаги не обнаруживаются через 5 минут инкубации.
К новым методам борьбы с бактериофагами можно отнести фотокатализ. Можно отметить несколько преимуществ фотокатализа, что делает этот метод отличной альтернативой традиционной химической дезинфекции: отсутствие остатков, одновременная обработка различных смесей загрязняющих веществ, широкий спектр применения и простота в эксплуатации.
Кроме того, низкая стоимость, высокая распространённость и безопасность TiO2 делают это соединение наиболее часто используемым катализатором.
Недавние исследования показали, что фотокатализ с использованием TiO2 является эффективным методом инактивации фагов, поражающих несколько видов молочнокислых бактерий. Фотокатализ (ультрафиолетовое излучение и TiO2) успешно применяется для борьбы с фагами в биоаэрозолях.
При производстве молочных продуктов сырое молоко подвергают термической обработке, чтобы уничтожить большинство присутствующих в нём микроорганизмов, в том числе вызывающих порчу и патогенных, тем самым обеспечивая высокое качество и более длительный срок хранения конечного продукта.
Однако, комбинации температуры и времени, часто используемые для пастеризации молока, то есть низкая температура/длительное время (63 °C, 30 мин) или высокая температура/короткое время (72 °C, 15 с) недостаточны для уничтожения большинства фагов молочнокислых бактерий.
Особенно высокая термоустойчивость наблюдалась у фагов, инфицирующих Lc. lactis, Lactobacillus helveticus, Strep. thermophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Leuconostoc pseudomesenteroides, Leuconostoc mesenteroides и Lactobacillus delbrueckii. Для уничтожения 99% фагов путем термической обработки молока при 72 °C потребовалось длительное время — до 300 минут.
Важно учитывать, что фаги обычно весьма чувствительны к кислым (pH < 4) и щелочным (pH > 11) средам. Например, гипохлорит натрия, этанол и изопропанол не обеспечивают значительного снижения количества фагов. Гипохлорит натрия показывает хорошую эффективность только в концентрациях, превышающих допустимые в пищевой промышленности.
Надуксусная кислота, дезинфицирующие средства и другие биоциды с экстремальными значениями pH, такие как щелочная хлоридная пена (pH 12,7) и этоксилированный нонилфенол с фосфорной кислотой (pH 1,7), продемонстрировали хороший эффект в инактивации фагов. При использовании биоцидов в концентрациях, рекомендованных производителями, фаги не обнаруживаются через 5 минут инкубации.
К новым методам борьбы с бактериофагами можно отнести фотокатализ. Можно отметить несколько преимуществ фотокатализа, что делает этот метод отличной альтернативой традиционной химической дезинфекции: отсутствие остатков, одновременная обработка различных смесей загрязняющих веществ, широкий спектр применения и простота в эксплуатации.
Кроме того, низкая стоимость, высокая распространённость и безопасность TiO2 делают это соединение наиболее часто используемым катализатором.
Недавние исследования показали, что фотокатализ с использованием TiO2 является эффективным методом инактивации фагов, поражающих несколько видов молочнокислых бактерий. Фотокатализ (ультрафиолетовое излучение и TiO2) успешно применяется для борьбы с фагами в биоаэрозолях.
Польза фагов
Следует также отметить и интерес к фагам как к эффективным бактерицидным агентам. Таким образом, фаги рассматриваются как агенты биологического контроля патогенных и вызывающих порчу бактерий в пищевых продуктах.
Фаги обладают рядом преимуществ перед антибиотиками, повсеместно присутствуя в пищевых продуктах, и поэтому контакты человека с фагами регулярны и постоянны. Бактериофаги не изменяют органолептические свойства пищевых продуктов и обычно сохраняют стабильность в течение длительного хранения.
Они могут стать единственной надежной альтернативой в борьбе с полирезистентными бактериями. Кроме того, фаги специфичны и атакуют отдельные виды или штаммы, используя литический механизм.
Исследования показали, что добавление фагов после сбора молока может снизить уровень Staph. aureus в сыром молоке, полученном от коров, больных маститом, и/или при загрязнении доильного оборудования. Хотя золотистый стафилококк не выживает при пастеризации, он может продуцировать термостабильные токсины, которые остаются активными после приготовления пищи.
Применение фагов против золотистого стафилококка было успешно исследовано в цельном молоке, подвергнутом ультрапастеризации и традиционной пастеризации, а также в процессе производства и созревания сыра и для устранения биопленок, которые являются основной причиной повторного роста патогенных бактерий в молочных продуктах.
Надлежащая гигиена, строгая и регулярная обработка оборудования, а также обеспечение правильной циркуляции воздуха являются ключевыми факторами для снижения размножения фагов. Также необходимо минимизировать риск перекрестного загрязнения между бактериальной средой, побочными продуктами ферментации и заводским оборудованием путем использования отдельных производственных зон для каждого процесса.
В любом случае для достижения лучших результатов в борьбе с фагами следует применять две или более стратегий, направляя усилия на поиск оптимальных комбинаций, которые позволят добиться синергетического эффекта, обеспечив при этом максимально возможную степень инактивации фагов.
Фаги обладают рядом преимуществ перед антибиотиками, повсеместно присутствуя в пищевых продуктах, и поэтому контакты человека с фагами регулярны и постоянны. Бактериофаги не изменяют органолептические свойства пищевых продуктов и обычно сохраняют стабильность в течение длительного хранения.
Они могут стать единственной надежной альтернативой в борьбе с полирезистентными бактериями. Кроме того, фаги специфичны и атакуют отдельные виды или штаммы, используя литический механизм.
Исследования показали, что добавление фагов после сбора молока может снизить уровень Staph. aureus в сыром молоке, полученном от коров, больных маститом, и/или при загрязнении доильного оборудования. Хотя золотистый стафилококк не выживает при пастеризации, он может продуцировать термостабильные токсины, которые остаются активными после приготовления пищи.
Применение фагов против золотистого стафилококка было успешно исследовано в цельном молоке, подвергнутом ультрапастеризации и традиционной пастеризации, а также в процессе производства и созревания сыра и для устранения биопленок, которые являются основной причиной повторного роста патогенных бактерий в молочных продуктах.
Надлежащая гигиена, строгая и регулярная обработка оборудования, а также обеспечение правильной циркуляции воздуха являются ключевыми факторами для снижения размножения фагов. Также необходимо минимизировать риск перекрестного загрязнения между бактериальной средой, побочными продуктами ферментации и заводским оборудованием путем использования отдельных производственных зон для каждого процесса.
В любом случае для достижения лучших результатов в борьбе с фагами следует применять две или более стратегий, направляя усилия на поиск оптимальных комбинаций, которые позволят добиться синергетического эффекта, обеспечив при этом максимально возможную степень инактивации фагов.